国产又粗又猛又黄又爽无遮挡,日产精品久久久久久久性色,精品一区,国产无套精品一区二区

產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST

首頁(yè) > 技術(shù)與支持 > 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR) 實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR) 實(shí)驗(yàn)步驟
點(diǎn)擊次數(shù):325 更新時(shí)間:2024-09-29

       實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實(shí)時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針,當(dāng)與擴(kuò)增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出信號(hào),從而可以對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達(dá)分析、病毒載量定量和基因突變檢測(cè)等應(yīng)用。

RT-qPCR原理的三個(gè)主要步驟:

1 反轉(zhuǎn)錄

使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。

反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中使用特定引物。

2 PCR擴(kuò)增:

使用特定引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域。

PCR是一個(gè)循環(huán)過(guò)程,呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增DNA模板的數(shù)量。

PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針,它們結(jié)合到擴(kuò)增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號(hào)。

3 熒光實(shí)時(shí)檢測(cè):

使用實(shí)時(shí)PCR儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。

熒光的數(shù)量與每個(gè)PCR循環(huán)中擴(kuò)增的DNA數(shù)量成比例。

使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值(Ct)值,該值表示熒光信號(hào)達(dá)到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計(jì)算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量,從而允許進(jìn)行基因表達(dá)或病毒載量等定量分析。


實(shí)驗(yàn)步驟:

1、RNA提?。篟NA的提取是參照全式金生物的Transzol up提取試劑盒完成的。

A、離心機(jī)4℃預(yù)冷,準(zhǔn)備試劑:氯仿、異內(nèi)醇、75%乙醇(用DEPC水配制)、無(wú)RNase的水或DEPC水、無(wú)酶吸頭及試管,戴口罩、帽子、無(wú)粉乳膠手套;

B、取出轉(zhuǎn)染建模成功24h后的細(xì)胞,吸棄培養(yǎng)液,用1×PBS清洗1次;

C、每10cm2生長(zhǎng)的細(xì)胞加入1mL的Transzol Up, 放置片刻后使用移液槍吹打細(xì)胞使其全脫落;

D、用移液槍反復(fù)吹吸裂解液直至無(wú)明顯沉淀,將裂解液全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的1.5mL EP管中,室溫靜置5min;

E、往每個(gè)EP管中加0.2mL氯仿(Transzol Up體積的1/5),混勻振蕩30s,室溫靜置3min;

F、4℃條件下10000g離心15min,離心后RNA主要分布在上層水相中,體積約50%;

G、轉(zhuǎn)移上層水相于新的EP管中(約400μL,注意不要吸取到下層),每管加入0.5mL異丙醇 (Transzol Up體積的1/2),顛倒混勻,室溫孵育10min;

H、4℃下10000g離心10min后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀,吸棄上清,加1mL 75%乙醇吹懸沉淀;

I、4℃下7500g離心5min后棄上清,盡量吸凈,室溫晾干沉淀5min,依細(xì)胞量加入30~100μL的RNA溶解液;

K、55℃~60℃金屬浴10min,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>


2、cDNA合成:見(jiàn)上文

3、qPCR:按表2.6,在ABI熒光定量PCR儀專用96孔板中建立qPCR反應(yīng)體系,反應(yīng)程序?yàn)閮刹椒ǎū?.11)

QQ截圖20240929141828.jpg


4、RT-qPCR統(tǒng)計(jì):每個(gè)基因在不同組別中的表達(dá)在獲得3個(gè)重復(fù)的Ct值后,從ABI系統(tǒng)中拷貝原始數(shù)據(jù),挑出“Ct SD"值大于0.5的組別(需重新實(shí)驗(yàn)),求出各個(gè)組的管家基因GAPDH的均值(一般相差1個(gè)Ct值以內(nèi)),再依次求出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組與各自的GAPDH之間的Ct差值,即得到第一個(gè)ΔCt,隨后求出實(shí)驗(yàn)組ΔCt和對(duì)照組ΔCt的差值,即可得到第二個(gè)ΔCt(ΔΔCt),最后使用2 -ΔΔCt法求出實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的Ct值變化倍數(shù)(實(shí)驗(yàn)組2 -ΔΔCt/對(duì)照組2 -ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組2 -ΔΔCt/2 0=實(shí)驗(yàn)組2 -ΔΔCt)。將3組實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad 9.0,輸入對(duì)照組數(shù)據(jù)為1,使用Student's t或ANOVA進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn),p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。


小SAO货水好多真紧| 国产又爽又黄又爽又刺激| 国产睡熟迷奷系列精品| 无码熟熟妇丰满人妻啪啪软件| 我朋友的妻子2018| 性色A∨亚洲一区二区三区| 小12萝裸体自慰出白浆| 黄金网站免费下载安装| 处破初破苞一区二区三区| 国产免费久久精品国产传媒| 京香julia| 国产亚洲精品久久久久久久软件 | 一女被五男在别墅调教| 亚洲第一极品精品无码久久| かしこまりました中文在线| 讲讲和对象第一次的细节知乎| 97精品国产97久久久久久免费| 打开这个网站你会感谢我的| 人妻系列无码专区免费视频| 久久精品国产99久久丝袜 | 最近日本mv字幕免费观看| 成熟女人毛片www免费版在线| 熟妇五十路六十路息与子| 亚洲av乱码一区二区三区香蕉 | 老阿姨才是最有味道| 99精品国产兔费观看久久| 成人免费在线电影| 7777精品久久久大香线蕉| 极品教师在线观看免费完整版| 2020国产情侣在线视频播放| 无码精品a∨在线观看十八禁| 羞羞漫画在线观看| 亚洲午夜无码久久久久软件| 男生下面伸进女人下面的视频| 苍井空在线av播放| 男人吃奶摸下挵进去啪啪软件| 久久精品99国产精品日本| 国内精品久久久久影院欧美| 日韩蜜桃一区二区三区 | 日本a片无码中文字幕电影| 99热久久精里都是精品6|