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細胞冷凍實驗重點事項
點擊次數(shù):73 更新時間:2024-12-03

       細胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中,在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準備工作方面都需大量的耗費,而且細胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng),它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細胞儲存在液氮中,溫度達-196℃,理論上儲存時間是無限的。

一、實驗原理:

隨著溫度降低,細胞內(nèi)的酶活性會逐漸降低,到-70℃左右,酶活性幾乎為0,代謝活動停止,可以實現(xiàn)長期保存。然而,隨著溫度降低,細胞內(nèi)外的水分也會“結(jié)冰"并形成冰晶,冰晶能導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等,能引起細胞死亡。因此常加入冷凍保護劑甘油或二甲基亞砜(DMSO)。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞,降低冰點,延緩凍存過程,同時增加細胞膜的通透性,提高細胞內(nèi)離子濃度,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而達到保護細胞的目的。

二、實驗步驟

1. 制備凍存液,凍存液比例:本實驗室采用70%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO,不同實驗室及不同細胞可能略有差異,也可采用55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO;

2. 取形態(tài)良好,處于對數(shù)生長期的細胞,對其消化、離心 (1500rpm離心8min)、計數(shù);

3. 根據(jù)細胞數(shù)量加入對應(yīng)的凍存液,使細胞密度維持在300-500w/mL;

4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋,每管分裝1-1.5mL含細胞的凍存液,擰緊蓋管,做好標記。

5. 分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放-80℃過夜;

6. 若沒有程序降溫盒,則按下列順序依次降溫:室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜,注意轉(zhuǎn)移過程中要保冷,避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化;

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長期保存。

三、注意事項:

1. 為保持細胞最大存活率,一般都采用慢凍存融的方法。

2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為-1℃~12℃/分鐘,當(dāng)溫度下降達-25℃時,下降速度可增至-5~-10℃/分鐘,到-100℃時則可迅速凍入液氮中。因此要適當(dāng)掌握凍存物下降入液氮中的速度,過快能影響細胞內(nèi)水分透出,太慢則促冰晶形成。

3. 初次凍存者在下降凍存時,宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置,然后需用溫度計與凍存物并行的辦法,以觀測下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系,當(dāng)已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后,僅按下降時間和下降距離便可獲理想凍存效果。

4. 各種細胞對凍存速度的要求也不一樣;上皮細胞和成纖維細胞耐受性可能大些,骨髓干細胞-2~-3℃/分鐘合適;胚胎細胞耐受性較小,不宜太快??傊谝婚_始時,下降速度不能超過-10℃/分鐘。

5. 用什么防護劑合適和用量多大,要依細胞而定,初代培養(yǎng)細胞用DMSO 較好,一般細胞可用甘油;用量以較小為好。有人認為人皮膚上皮細胞貯存在20%-30%甘油中很好。

6. 原則上細胞在液氮中可貯存多年,但為妥善起見,凍存一年后,應(yīng)再復(fù)蘇培養(yǎng)一次,然后再繼續(xù)凍存。

7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護工作,以免凍傷

8. 注意自身的安全,對于來自人源性或病毒感染的細胞株應(yīng)特別小心。操作過程中,應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生,小心有毒性試劑例如DMSO,并避免尖銳物品傷人等。


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